流式细胞仪在植物科学领域中的应用及方法举例

来源：SCI期刊网 分类：农业论文 时间：2022-01-10 09:30 热度：

　　摘 要：流式细胞术是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。自发明以来，流式细胞仪已被广泛应用在生物学和医学的各个研究领域，极大地推动着生物学和医学的发展和应用。该文阐述了流式细胞仪在植物科学领域应用，如细胞核分析、染色体分析、植物细胞和染色体分选、染色体文库构建、逆境生物学及育种学等等，并对应用实例进一步进行了说明，为流式细胞仪在植物学领域的进一步应用推广提供借鉴。

　　关键词：流式细胞仪;植物科学;应用;方法

　　流式细胞仪是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的仪器。它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学为一体，按照细胞的物理或化学性质，进行细胞的分析和分选 [1-3] 。自 1974年BD(Becton，Dickinson and Company)公司研制出第一台商用流式细胞仪(Fluorescence Activated Cell Sorting，FAC⁃ STM)以来，该技术方法又取得了巨大的进步，使得流式细胞仪在生物学，特别是医学领域得到了广泛的应用，被誉为“实验室的CT”。

　　由于植物细胞自身的细胞粘连、具有细胞壁等特性，使得流式细胞仪在植物科学的应用稍稍滞后于血液学、免疫学等领域。目前，流式细胞仪在植物育种、生长发育、生理生态、系统进化、分类等领域，分子、细胞、整体乃至系统生物学水平等领域[1-6] 都得到广泛应用。

　　1 流式细胞仪原理

　　细胞制备成单细胞悬浮液并经特定的荧光染料染色后上机，细胞悬浮液在仪器压力下形成流畅不间断的细小液流，使这些单个细胞一个一个依次通过一个小室，进入小室的细胞被激光激活，在散射一部分激光的同时，细胞也发出荧光，这些散射的光信号和发射的荧光信号均被收集并进行分析[7] 。荧光信号通过透镜、光阑及滤片到达光电倍增管，仪器将检测器测得的信号通过分析系统加以显示记录。流式细胞仪的测试结果是一个数据文件，它是由光信号强度经检测器(硅光电二极管或光电倍增管)转换成电信号输出，又经多道脉冲分析器和模-数转换，由微处理器编释成一种数据文件，并经相连的电脑及配置的软件系统将数据文件以图形的方式显示和数据统计分析(图1)[7] 。

　　2 流式细胞仪在植物科学领域的应用

　　2.1 植物细胞核分析 细胞核是细胞指令的发出场所和遗传物质的储存、加工及传递场所。流式细胞仪在细胞核分析方面涉及的应用范围颇为广泛，例如 DNA、RNA、蛋白质含量的分析，染色质结构分析，细胞周期分析染色体倍性分析等方面[8-12] 。

　　2.2 原生质体分析 正如前面所述，由于植物细胞结构的特殊性，流式细胞仪对植物细胞结构和功能的研究依赖于其原生质体的制备或细胞核的解离。通过对原生质体的分析研究植物细胞结构和功能等。通过流式细胞仪还可以研究原生质体产物分选，细胞融合产物分选，改良作物品种等方面[8-12] 。

　　2.3 植物细胞染色体分析和染色体文库构建 流式细胞仪利用荧光染色的方法能够识别和分拣单个染色体。分拣的单一的染色体是构建染色体专性DNA文库和基因定位的最好材料，因此流式分拣的染色体的一个主要用途是构建染色体专性文库，这些染色体文库可以广泛应用在基因组分析和基因定位克隆中[8-12] 。

　　2.4 植物细胞结构和功能研究 流式细胞仪已广泛应用到植物细胞结构的研究中。例如细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量、配体及特异抗原的研究中;流式细胞仪也被广泛应用在诸如细胞特异性抗原(细胞表面/胞浆/核)、细胞内细胞因子、细胞活性、酶活性、激素结合位点、细胞受体信号转导等功能性研究方面。这些应用为植物细胞生物学的研究提供了强大工具和理论基础，并不断丰富其发展[8-12] 。

　　2.5 植物分类学和植物系统学(Plant systematic)研究 植物分类学和植物系统学是根据植物的特征，植物间的亲缘关系、演化的顺序，对植物进行分类的科学，并在研究的基础之上建立和逐步完善植物各级类群的进化系统。流式细胞仪可在分子水平上对所研究物种待测的多个分子 Marker 如 DNA、RNA序列等同时进行检测，然后综合定性、定量分析，从而对物种进行特征、归类，并为其系统发育研究提供分子水平上的遗传证据[8-12] 。

　　2.6 逆境植物学和植物病理学(Plant pathology)研究 植物如何应对诸如干旱、低温、高温、盐碱、病虫害、环境污染等逆境胁迫是植物科学和农业科学共同关心的重大科学问题。逆境条件可以通过境信号在细胞中通过信号转导和传递，最终诱导基因表达;逆境胁迫也可以通过代谢来调节基因表达，合成抗冻蛋白(Antifreeze proteins，AFPs)、热激蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)、渗透调节蛋白(Osmotin)等抗逆蛋白质。然而植物抗逆的分子机制并不清楚。基于流式细胞仪在细胞信号传导和蛋白功能研究等方面的强大功能，已被广泛应用于植物抗逆研究和植物抗病研究中，流式细胞仪为抗逆因子和抗病因子的表达和活性检测提供了很好的工具[8-12] 。

　　2.7 植物育种研究 植物育种是植物科学和农业科学研究领域的另一重大科学问题，包括作物育种、园林植物育种等。 1984年，LAAT和BLAAS制备了模式植物纤细单冠菊[Haplo⁃ pappus gracilis(Nutt.)Gray]的完整染色体悬浮液，通过流式细胞术分离了2种染色体类型，开创了流式细胞遗传学[13] 。

　　流式细胞仪根据DNA含量的多少可以判断染色体的数量，从而可以鉴定植物倍性，达到快速准确的效果，尤其适用作物育种群体检测如多倍体育种。另一方面，通过对植物原生质体及染色体的分选使从分子水平上筛选特定优良基因，导入优良基因，改造物种成为了可能。流式细胞仪在植物育种中的应用，在提高作物抗逆能力和作物产量、培育园艺花卉等领域有着重要的研究意义。

　　3 流式细胞仪检测方法应该举例--细胞增殖能力

　　用流式细胞仪检测细胞增殖能力的方法主要有以下两种[13-17] ：

　　3.1 相对计数法 细胞增殖最直接的结果就是细胞数目的增加，如果控制样品的体积一定，细胞数目的增加就是细胞浓度的增加，那么在同一台仪器上用相同的分析速度上样计数时，浓度大的样品单位时间内被检测到的细胞数越多，上样相同时间后得到的相对细胞数也就越多。同时也可以设置检测相同数目的细胞个数后仪器自动停止并计时，通过分析各个检测样品的时间来比较细胞数目的相对多少，如果相同处理下样品检测时间短，则说明该样品的细胞浓度高，即细胞数目多;反之，则说明样品的细胞数量少。流式细胞术相对计数法测定细胞增殖的原理：将对照组和各实验组控制在相同的条件下直接计数，然后比较计数结果得出增殖结论。

　　3.2 细胞周期法 在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA 含量随着细胞增殖周期各时期不同而发生变化。(1)G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞，其细胞DNA含量为较恒定的2C;G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环，G1期细胞与 G0期细胞 DNA 含量相同，均为二倍体 DNA 含量;当细胞进入 S 期后， DNA含量逐渐增加，从2C→4C值，一直到细胞DNA倍增结束，进入G2期，最终进入M期。在M期分裂为二个子细胞之前，G2和 M 期细胞的 DNA 含量均为恒定的 4C 值，即为四倍体细胞。(2)荧光染料和细胞DNA分子具有特异性结合，且有一定的量效关系，①DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比;②荧光强度与 DNA 分子结合荧光素多少成正比;③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA定量分析一个细胞增殖群时，可将二倍体DNA含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1和 G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布。

　　4 总结和展望综上所述，流式细胞仪在植物科学领域的研究中已经得到了广泛的应用，几乎涉及到各个方面，极大地推动着植物学科的发展，并在植物科学研究中扮演着重要的作用。自从BD流式细胞仪发明以来，就不断利用新的科学技术手段不断革新，服务于生物学研究，本文通过对流式细胞仪在植物科学领域的应用及研究方法介绍，期望能取得更好的进展。——论文作者：黄秀清 郭伟志 马志慧 任 艳 张幸幸 黄小丹 丁国昌*

　　参考文献

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　　[2]焦旭雯，赵树进.流式细胞术在高等植物研究中的应用[J].热带亚热带植物学报，2006，14(4)：354-358.

　　[3]Nunez R.Flow cytometry for research scientists：principles and applications[M].London：Horizon Scientific Press，2001：1-3.

　　[4]van den Engh G.New applications of flow cytometry.Curr Opin Biotechnol.1993，4(1)：63-68.

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　　[6]Fleury D，Himanen K，Cnops G，Nelissen H，et al.The Arabidop⁃ sis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cy⁃ cle regulation during early leaf and root growth.Plant Cell.2007，19(2)：417-432.

　　[7]焦旭雯，赵树进.流式细胞术在高等植物研究中的应用[J].热带亚热带植物学报，2006，14(4)：354-358.

　　[8]Nunez R.Flow cytometry for research scientists：principles and applications [M].London：Horizon Scientific Press，2001：1-3.

　　[9]耿慧霞，王来，王强.流式细胞仪在生物学中的应用[J].生物学杂志，2005，22(4)：44-46.

　　[11]van den Engh G.New applications of flow cytometry.Curr Opin Biotechnol.1993，4(1)：63-68.

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　　[13]DE LAAT AMM，BLAAS J. Flow—cytometfic characterization and sorting of plant chromosomes[J].Theor Appl Genet，1984， 67：463-467.

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　　[16] Dolezel J and Bartos J (2005) Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.Ann Bot 95：99-110.

　　[17] Dolezel J，Kubaláková M，Bartos J，Macas J.Chromosome Res Flow cytogenetics and plant genome mapping.2004，12(1)：77- 91.

文章名称：流式细胞仪在植物科学领域中的应用及方法举例

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