有效微生物菌群（EM）对蟹鲈混养模式下养殖水体菌群结构的影响

来源：SCI期刊网 分类：农业论文 时间：2021-11-15 09:32 热度：

　　摘要为探究定期添加EM对蟹鲈混养养殖水质和菌群结构的影响，实验对混养水体进行了Ⅰ期(4月10号)、Ⅱ期(4月20号)、Ⅲ期(4月30号)和Ⅳ期(5月10号)的监测，并通过水质理化指标、16SrRNA基因高通量测序技术分析了每个时期的水质和菌群结构。高通量测序结果显示实验期间水体主要优势菌门为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、蓝细菌门，其中对照组蓝细菌门的相对丰度在Ⅲ、Ⅳ期显著高于实验组;实验组Ⅰ期最优势菌属为Limnohabitans(20.34%)，其余时期皆为微小杆菌属(56.33%、38.11%、17.88%);对照组Ⅰ期最优势菌属为红育菌属(10.37%)，Ⅱ期为微小杆菌属(47.67%)，Ⅲ期和Ⅳ期皆为分枝杆菌属，分别为36.01%和42.27%;Sobs和PD指数显示：实验样品在Ⅰ期、Ⅱ期差异不显著，但在Ⅲ期和Ⅳ期实验组显著高于对照组。相比于对照组，添加EM的实验组在整个监测期总氮(TN)显著降低，氨氮(NH4+-N)在Ⅰ期差异不显著，在Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期显著降低。关联分析显示，总氮是对菌群群落影响程度最大的环境因子，其中添加EM实验组的优势菌属微小杆菌属与总磷(TP)呈正相关，与TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N呈负相关，为池塘氨氮、总氮降解的益菌属;本研究表明蟹鲈混养模式下定期添加EM可以改善养殖水体水质，有效抑制蓝细菌，且显著优化菌群结构，具有显著的水体原位修复功能。实现了经济效应和生态效益的双赢，为形成典型池塘混养模式的水质原位生态调控技术奠定基础，促进我国水产养殖业的绿色生态可持续发展。

　　关键词EM;菌群结构;丰富度;原位修复

　　中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，又名大闸蟹，肉质鲜美且营养丰富，是我国重要的水产养殖经济动物[1]，养殖水体的水质是影响中华绒螯蟹生长发育的重要因素[2]，目前水草的种植在改善中华绒螯蟹养殖水体水质的应用较多，好的水质有利于中华绒螯蟹的生长，改善品质，提高营养价值[3]。大口黑鲈(Micropterussalmoides)，产地源于北美洲，又名加州鲈，是一种淡水肉食性鱼类，肉质鲜美，无肌间刺，研究历史悠久[4]，当前国内对于大口黑鲈鱼的养殖主要是以单养为主[5]，传统养殖模式下，经常会存在养殖密度高，养殖水体负担增大，在水体自净能力有限的情况下，发展绿色生态养殖是迫切的要求和必然的方向[6]。

　　蟹鲈混养是一种生态养殖模式，混养的概念源于范蠡的著作《养鱼经》，从经典的鱼-鳖混养发展到现在有鱼-鳖-虾、鱼-虾-蟹等多种养殖模式[7]，宋欣等[8]对草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鲤(Cyprinuscarpio)和凡纳滨对虾(LitopenaeusVannamei)进行了多元的混养实验，结果显示，混养能显著的提高养殖产品的产量，提高生态效益，在合适的密度下进行水产品的混合养殖实验可以提高经济和生态效益，蟹-鲈混养模式能够高效充分的利用空间，形成互惠互利的生态系统，降低发病率，改善环境，提高生态效益[9-10]。

　　EM是以(光合细菌、酵母菌、乳酸菌和放线菌为主)多种有益微生物复合而成的有效微生物群[11]，在动植物种养等方面有着良好的应用效果[12-13]。大量关于EM在环境治理方面的应用已被研究，证实了EM在水体、土壤、微生物等环境治理方面效果显著[14-16]。EM具有调水功能，其有益菌具有易存活和繁殖周期短，繁殖速度快等的特点，能在短时间内成为优势菌群，与病原菌竞争生长发育所需的物质，抑制水体中病原微生物的生长发育，在短时间分解水养动物的剩余饵料和排泄物，从源头上降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐等有毒害物质的含量，优化水质，为水养动物创造良好的水生态环境[17-18]。水体的微生物是水域生态系统的重要组成部分，微生物的群落结构与水质状况联系密切，也是衡量水域生态系统稳定性的重要指标[19]，认识养殖水体内微生物的结构，有助于了解养殖水体的生态环境和稳定性，对有针对性地改善水环境和选择养殖模式等具有重要的意义。本实验以日本比嘉照夫发明的EM复合益生菌作为研究对象，探究其对蟹鲈混养养殖水体原位修复效果，及其对养殖水体菌群结构的影响，以期形成“源头控制、过程净化和生态调控”典型池塘养殖模式水质原位生态调控技术，真正实现绿色生态养殖，促进我国水产养殖业的长期可持续发展。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　实验大口黑鲈购自安徽张林渔业有限公司;中华绒螯蟹购自江苏诺亚方舟农业科技有限公司;EM来源于江苏恒泰环保科技发展有限公司(EM发明者比嘉照夫合作方)，其活菌总数经中国水产科学院淡水渔业研究中心农业农村部新渔药临床试验中心鉴定，其pH为3.0～4.0;乳酸菌数1.0×106～1.0×107CFU/mL;酵母菌数1.0×104～1.0×105CFU/mL;光合菌数1.0～2.0×103×103CFU/mL;放线菌数1.0×103～3.0×103CFU/mL;菌种数>80种。

　　1.2养殖方法

　　养殖实验在中国水产科学院淡水渔业研究中心扬中基地选取6个标准池塘开展，池塘养殖面积为1666.7m2(2.5亩)，实验分为EM蟹鲈混养实验组(EMXL)和蟹鲈混养对照组(XL)，每组各3个重复池塘，塘内皆种植水草。蟹的放养时间为2020年2月22号，放养规格为40只/500g，放养密度为500只/666.7m2;大口黑鲈放养时间为2020年4月2号，放养规格为184g/尾，放养密度为1500尾/666.7m2。养殖实验期间，大口黑鲈每天投喂2次，喂料量为大口黑鲈体质量的3%~5%;螃蟹每2日投喂1次，喂料量为螃蟹体质量的3%～5%。实验开始后，EM混养实验组3个池塘每隔10d对全塘按500g/666.7m2的比例进行EM泼洒，对照组池塘不泼洒。每个养殖池塘均配备微孔增氧机，夜间开启增氧设备，维持塘内溶氧不低于5mg/L。

　　1.3样品的采集和处理

　　EM从4月5日开始泼洒，每10d泼洒1次;实验水样的采集于4月10号(EM泼洒5d后)开始，往后每隔10d采集1次，到5月10号为止(表1)。水样采集采用5点取样法，采取水面50cm下的水样。将每个水样混匀后，取1L用于水体水质理化指标的测定，3L用于测定微生物。水质理化因子测定方法：水体中的氨氮(NH4+-N)纳氏试剂分光光度比色法、亚硝酸氮(NO2—N)分光光度法(GB/T7493—1987)、硝氮(NO3--N)锌-铬还原法、总氮(TN)采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB11894—89)，总磷(TP)采用钼酸铵比色法(GB11893—89)、化学需氧量(COD)采用碱性高锰酸钾法(GB11914—89)。用于测定水体微生物的水样混匀后4℃、12000r/min的条件下离心30min，取沉淀置于无菌离心管中，标记于-80℃保存。

　　1.4样品DNA提取及PCR扩增

　　根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(OmegaBio-tek,Norcross,GA,美国)说明书进行总DNA的抽提，DNA的浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对细菌16SrRNA基因的V3~V4可变区进行PCR扩增，扩增程序：95℃预变性180s;95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环;72℃延伸10min。反应体系(20μL)：4μL5×FastPfu缓冲液、2μL2.5mmol/LdNTPs、0.8μL引物(5μmol/L)、0.4μLFastPfu聚合酶;10ngDNA模板。

　　1.5IlluminaMiseq测序

　　以2%的琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit(Axygen，美国)进行纯化，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。通过QuantiFluor™-ST(Promega,美国)进行定量检测。根据IlluminaMiSeq平台(Illumina,SanDiego,美国)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建测序文库，后利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

　　1.6数据分析

　　原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：设置50bp的窗口，当窗口内的平均质量低于20bp时，从窗口前端位置截去该碱基后端所有序列，后再去除质控后长度低于50bp的序列;根据重叠碱基overlap，将两端序列拼接，长度需大于10bp，overlap间的最大错配率是0.2;根据序列首尾两端的barcode及引物将序列拆分到每个样本，barcode匹配要精确，引物可有2个碱基的容错，去除模糊碱基序列。使用UPARSE软件，根据97%的相似度水平对序列进行OTU聚类。使用双因素方差分析进行统计学检验，P<0.05认为差异显著;水体理化指标、微生物多样性指数及主要菌属的相对丰度间的差异通过Canoco5软件分析。

　　2结果

　　2.1水质理化指标

　　水质指标测定结果(表2)显示，实验组的总氮含量在整个测定期皆显著低于对照组(P<0.05)，且实验组Ⅳ期的含量与Ⅰ期持平，对照组Ⅳ期测定含量比Ⅰ期增长了83.9%，结果表明EM对蟹鲈混养模式下养殖水体总氮的降除率较高，可达(48.75%~69.75%);在Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期，实验组的氨氮含量显著低于对照组(P<0.05)，在Ⅰ期差异不显著;4个时期对照组总磷的含量皆显著低于实验组(P<0.05)，实验组Ⅳ期总磷的测定含量与Ⅰ期持平，对照组的总磷含量逐渐上升，Ⅳ期测定含量比Ⅰ期增长了166.7%;2组的亚硝酸氮、硝酸氮、和COD在整个测定期差异不显著(P>0.05)。

　　2.2测序数据

　　测序结果质检后显示，2个处理组的24个样品有效序列数共有1029593条，有效序列的平均长度为417bp。样品的物种覆盖率大于98.99%(从98.99%~99.54%)(表3)。以97%相似水平对样品的测定序列进行了OTU划分，可划分成1981个OTU，物种注释结果显示为33门93纲228目381科701属1177种。

　　相关期刊推荐：《水产学报》(月刊)创刊于1964年，是由中国水产学会主办、上海海洋大学承办的以水产科学技术为主的学术性刊物。主要反映我国水产科学研究成果及发展方向，为国内外水产学术交流服务。主要刊载水产基础研究、水产养殖和增殖、渔业水域环境保护、水产品保鲜加工与综合利用、渔业机械仪器等方面的论文、研究简报和综述。所发表的论文主要是国家自然科学基金、国家攀登计划、国家“863”和“973”计划、国家重点科技攻关、“长江学者计划”和国际合作研究等重大项目的研究成果，代表了我国水产学科的学术水平和发展动向，反映了我国水产科技研究的新成果、新思路。是广大从事水产专业的科研人员、生产管理人员和高校师生推广成果、探讨学术的一块园地，在科研和教学中具有重要的参考作用。

　　对样品测序结果构建了Venn图，不同处理组不同时期通有的OTU数目为164个(8.28%)，说明微生物种类的分布集中度较低，养殖塘内水体菌群差异较大。在I期和Ⅱ期，对照组独有OTU数量大于实验组，但Ⅲ期和Ⅳ期，实验组独有OTU数量大于对照组，实验组的OTU初始测定值最低仅为645个，但随着时间的增加其菌群数目不断增加，最终测定菌群数为1340个，比初始测定时增加了107.8%，而对照组最终测定菌群数比初始测定时减少了8.3%(图1)。表明蟹鲈混养模式下在池塘中添加EM可以提高池塘水体细菌菌群数量。

　　2.3菌群组成分析

　　对2种处理下4个监测时期养殖水体样本中的微生物群落进行统计。实验组中丰度大于1%(图2)菌门为变形门(Proteobacteria37.30%)、放线菌门(Actinobacteriota31.70%)、Bacteroidota(29.00%)(Ⅰ期);厚壁菌门(Firmicutes57.81%)、变形门(20.19%)、放线菌门(17.29%)、蓝细菌门(Cyanobacteria2.50%)(Ⅱ期);厚壁菌门(48.19%)、放线菌门(20.11%)、变形门(19.34%)、Bacteroidota(5.76%)、Deinococcota(4.99%)(Ⅲ期);放线菌门(45.13%)、厚壁菌门(24.61%)、变形门(22.88%)、Patescibacteria(2.05%)、Deinococcota(1.97%)、Bacteroidota(1.62%)(Ⅳ期)。其中，放线菌门、变形门始终是实验组优势菌门，厚壁菌门在除I期外的其余时期是优势菌门。对照组中丰度大于1%的菌门：Ⅰ期为变形门(52.12%)、放线菌门(24.26%)、厚壁菌门(8.52%)、Bacteroidota(8.17%)、蓝细菌门(6.02%);Ⅱ期为厚壁菌门(50.32%)、变形门(23.91%)、放线菌门(21.69%)、Deinococcota(1.32%)、Bacteroidota(1.10%);Ⅲ期为放线菌门(50.67%)、变形门(31.20%)、厚壁菌门(12.31%)、蓝细菌门(2.93%)、Verrucomicrobiota(1.94%)，Ⅳ期为放线菌门(56.43%)、蓝细菌门(20.90%)、变形门(14.35%)、厚壁菌门(3.84%)、SAR324-cladeMarine-group-B(1.10%)，其中放线菌门、变形门、厚壁菌门为对照组4个时期的优势菌门。

　　菌门差异分析结果显示，Ⅰ期2组中Proteobacteria、Bacteroidota、Bdellovibrionota等丰富度存在显著差异(P<0.05);Ⅱ期主要菌门间差异不显著;Ⅲ期Actinobacteriota、Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota等存在显著差异(P<0.05);Ⅶ期Cyanobacteria、Patescibacteria、Bacteroidota等差异显著(P<0.05)。Ⅰ期和Ⅱ期2组在蓝细菌门相对丰度上没有显著性差异，但Ⅲ期对照组蓝细菌门的相对丰度显著高于实验组(P<0.05)(图3)，在Ⅳ期极显著高于实验组(P<0.01)，表明蟹-鲈混养模式下定期添加EM对水体蓝细菌门有一定的抑制作用，但是有一段响应时期，间隔10d天持续添加3次以上有显著的抑制效果。

　　对2种养殖模式下水体样本中微生物群落丰度大于1%的菌属进行统计(图4)，实验组和对照组水体中的优势菌属主要是微小杆菌属(Exiguobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、Aurantimicrobium等，对照组Ⅰ期最优势菌属为红育菌属(Rhodoferax)(10.37%)，Ⅱ期为微小杆菌属(47.67%)，Ⅲ期和Ⅳ为分枝杆菌属且占比较大分别为36.01%和42.27%。实验组Ⅰ期最优势的菌属为：Limnohabitans(20.34%)，其余时期皆为微小杆菌属，其中以Ⅱ期占比最高达56.33%;Limnohabitans在I期的实验组和对照组中占比较大分别为20.34%和4.09%，在其它时期皆低于1%。

　　2.4菌群多样性

　　Alpha多样性分析结果显示，养殖水体微生物的Sobs指数和PD指数在I期和Ⅱ期没有显著的差异，但在Ⅲ期和Ⅳ期实验组显著高于对照组(图5)，说明蟹鲈混养模式下定期添加EM可以提高养殖水体微生物群落数量和种类。

　　在属水平上进行了主坐标分析(PcoA)，图中一个符号代表一个样品，相同颜色的符号代表同一组，横轴(PC1)贡献度为35.52%，纵轴(PC2)贡献度为34.89%。符号间的距离代表了样品间微生物群落的差异，距离越小差异越小，反之则越大。在Ⅰ期和Ⅱ期，实验组和对照组在PCoA图中的距离较小，但Ⅲ期与Ⅳ期实验组和对照组在PCoA图中的距离较大，群落差异较大(图6)。表明，定期添加EM对蟹-鲈混养水体菌群结构的影响有一段响应时期，间隔10天持续添加3次以上可以发生显著变化。

　　2.5菌群与水质理化因子相关性

　　每个时期选取6种主要差异OTU(表4)进行冗余分析(RDA)分析，结果显示：选取的差异OTU与水质指标TN、NH4+-N、TP具有明显的相关性，其中OTU1981、OTU1857和OTU777与TN、NH4+-N呈正相关，都出现在Ⅲ期和Ⅳ期，在EM实验组丰度(37～444.33)显著低于对照组(1565.33～7412.33)，属于分枝杆菌属(图7)。

　　选取4个时期中10种主要优势菌属与环境因子进行了CCA分析，结果显示为环境因子中TN、NH4+-N、COD对水体微生物群落的影响最大，检验的结果显示TN对于水体细菌菌落的分布具有显著的影响(P<0.05)，TN对水体微生物群落变异的解释度为25.1%(图8)，可以认为TN是驱动水体群落变异的主要因子。图中M5、M9与TP呈正相关;M2、M3、M6、M7、M9、与COD、TN、NH4+-N、NO2--N呈负相关，M1、M4、M8、M10与TN、NH4+-N、NO2--N呈正相关，与TP呈负相关。

　　3讨论

　　高密度的养殖会使水体负担加重，导致水体恶化，致使病害频发。传统池塘养殖需要大量换水，不仅浪费资源还会影响周围水域环境[20]。合理的混养可以在高密度养殖的情况下起到调控水质的作用，刘伟杰等[21]研究发现混养模式下池塘NH4+-N、TN等指标显著低于单养池塘。利用生物修复是发展可持续的生态养殖的一种良好方法，因为良好的生物修复系统能有效地清除水中的碳化物、氮化废物等。水体添加有益微生物可以改善水质，促进水体营养元素的去除，减少有害菌的增生[22]。大量研究已经表明EM菌具有降低水中总磷、总氮、氨氮、亚硝酸盐氮以及化学需氧量的作用[23,24]。夏来根等[24]研究发现，EM调水剂能有效的降低水体COD、NH4+-N、NO2--N的含量。本实验结果表明，EM能有效降低养殖水体氨氮和总氮的含量，具有改善和调控水质的作用。

　　通过调节环境因子，改善微生物群落的组成，可达到抑制致病微生物的传播，为疾病控制提供有益的线索的作用[25]，因此探讨水产养殖过程中微生物群落的组成和多样性及其与环境因子的相互作用是必要的。水环境中的有益菌和病原菌存在拮抗作用，有益菌群易存活、繁殖周期短、繁殖速度快，能在短时间内成为优势菌群，与病原菌竞争生长发育所需的物质，进而抑制水体中病原微生物等的生长发育[26]。分枝杆菌属种类多，多数为致病菌，可引起人畜等动物出现结核病、麻风病或其他慢性坏死或肉芽瘤肿病[27]，研究表明斑马鱼(Brachydanioreriovar)对分枝杆菌十分敏感，严重可导致斑马鱼爆发性死亡[28]。本实验结果显示分枝杆菌属与水体总氮的含量呈正相关，且对照组水体总氮含量显著高于实验组，表明在蟹-鲈混养模式中添加EM可以有效降低池塘总氮的含量，减少病害菌。与前人研究结果[29]一致，本研究结果得出总氮是影响细菌群落结构的主要因素。微小杆菌属与总磷含量呈正相关，它是一种多功能菌属，多样性和适应能力强，它能促进植物生长、提高生产力，可作为一种重要的资源来设计生态友好的生物替代品，并促进农业的可持续发展[30]。薛菲菲[31]发现，微小杆菌对养殖池溏的氨氮降解效果较好。本研究发现微小杆菌属在实验组的Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期含量较高，这表明在蟹鲈混养模式下持续添加EM可以提高微小杆菌属的丰富度，改善水体微生物菌群结构，对氨氮、总氮的降解具有积极作用。有研究表明适量的磷含量有益于甲壳动物和浮游植物的生长[32]，本实验中添加EM的养殖池溏总磷含量显著高于对照池塘，更有利于中华绒蟹的生长;蓝细菌门一般指蓝藻，主要生长于淡水中，是导致“水华”发生的元凶。蓝藻能分泌许多毒素，使肌肉和神经等产生不可逆的病理变化，对生殖系统和心脏等也有较多负面影响[33]，研究结果表明EM对蓝细菌门有明显的抑制作用，但是需要一定的时间。

　　生态系统越复杂其稳定性越高，养殖池塘作为小型生态系统其组成也包括水体的微生物，微生物种类和丰富度越高，其生态系统越复杂，稳定性也越强[34]。生物多样性对于缓冲环境变化和干扰具有重要作用，同时对于巩固生态系统服务具有积极作用[35]。裘琼芬等[36]认为水环境的稳定与微生物丰富度密切相关，水体微生物丰富度下降，会使养殖病害的风险提高。本实验发现蟹鲈混养模式下添加EM可以有效提高池塘水体微生物物种丰富度，提高有益菌群的数量，减少有害菌群的滋生，使养殖水体的生态系统稳定性有所提高。综上所述，EM在蟹鲈混养模式中有着很好的应用效果，它可以提高养殖池溏水体微生物丰富度，抑制蓝细菌的生长，降低养殖水体总氨氮、总氮等指标的含量，对于改善水质和维持池塘水环境稳态具有积极作用。——论文作者：李士恒1,聂志娟2,沈雷1,邵乃麟2,孙毅2,徐钢春1,2,徐跑1,2*

文章名称：有效微生物菌群（EM）对蟹鲈混养模式下养殖水体菌群结构的影响

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